Le ricerche che descrivono la caratterizzazione immunologica dei tumori e l’identificazione di
biomarcatori associati alla risposta alle immunoterapie che sono alla base della piattaforma
ONCO-ND1 sono descritte in alcuni delle pubblicazioni, in larga parte congiunte fra i gruppi di
ricerca del Prof. Michele Ceccarelli, del Prof. Davide Bedognetti e del Prof. Antonio Iavarone
che seguono:

• Roelands, J., W. Hendrickx, G. Zoppoli, R. Mall, M. Saad, K. Halliwill, G. Curigliano, D.
  Rin- chai, J. Decock, L. G. Delogu, M. Ceccarelli, and D. Bedognetti (2020).
  Oncogenic states dictate the prognostic and predictive connotations of intratumoral
  immune response. Journal for immunotherapy of cancer 8(1).
• Hendrickx, W., I. Simeone, S. Anjum, Y. Mokrab, F. Bertucci, P. Finetti, G. Curigliano, B.
  Seliger, L. Cerulo, S. Tomei, L. G. Delogu, C. Maccalli, E. Wang, L. D. Miller, F. M.
  Marincola, M. Ceccarelli, and D. Bedognetti (2017). Identification of genetic
  determinants of breast cancer immune phenotypes by integrative genome-scale
  analysis. OncoImmunology 6(2), e1253654.
• Zhang, J., F. P. Caruso, J. K. Sa, S. Justesen, D.-H. Nam, P. Sims, M. Ceccarelli, A.
  Lasorella, and A. Iavarone (2019). The combination of neoantigen quality and T
  lymphocyte infiltrates identifies glioblastomas with the longest survival. Communications
  Biology 2(1), 135.
• Turan, T., S. Kongpachith, K. Halliwill, J. Roelands, W. Hendricks, F. M. Marincola, T. J.
  Hudson, H. J. Jacob, D. Bedognetti, J. Samayoa, and M. Ceccarelli. A balance score
  between im- mune stimulatory and suppressive microenvironments identifies mediators
  of tumor immunity and predicts pan-cancer survival. British Journal of Cancer (2020).
• Bedognetti D, Ceccarelli M, et al . Toward a comprehensive view of cancer immune
  responsiveness: a synopsis from the SITC workshop. Journal for Immunotherapy of
  Cancer. 2019 May 22;7(1):131.A
• ngelova M, Mlecnik B, Vasaturo A, Bindea G, Fredriksen T, Lafontaine L, Buttard B,
  Morgand E, Bruni D, Jouret-Mourin A, Hubert C, Kartheuser A, Humblet Y, Ceccarelli M,
  Syed N, Marincola FM, Bedognetti D, Van den Eynde M, Galon J. Evolution of
  Metastases in Space and Time under Immune Selection. Cell 2018 Oct
  18;175(3):751-765.
• Bertucci F, Finetti P, Simeone I, Hendrickx W, Wang E, Marincola FM, Viens P,
  Mamessier E, Ceccarelli M, Birnbaum D, Bedognetti D. The immunologic constant of
  rejection classification refines the prognostic value of conventional prognostic signatures
  in breast cancer. British Journal of Cancer. 2018 Nov;119(11):1383-1391.
• Thorsson V, Gibbs,… Bedognetti D, et al.. The immune landscape of cancer.
  Immunity, 2018
• Wang E, Bedognetti D, Marincola FM. Prediction of response to anticancer
  immunotherapy using gene signatures. Journal of Clinical Oncology 2013
  – Bhardwaj N,…Bedognetti et al. Flt3 Ligand Significantly Augments Immune Responses
  to a Dendritic Cell Targeting anti-DEC-205-NY-ESO-1 Vaccine through Expansion of
  Dendritic Cell Subsets, Nature Cancer (in press).
• Sayaman R, Saad M, Thorsson V, Wouter Hendrickx, Roelands J, Mokrab Y, Farshidfar
  F, Kirchhoff T, Sweis RS, Bathe OD, Porta-Pardo E, Campbell MJ, Stretch C, Hu D,
  Huntsman S, Graff RE, Syed N, Radvanyi L, Shelley S, Wolf D, Marincola FM,
  Ceccarelli M, Galon J, …., Ziv E, Bedognetti D. Germline genetic contribution to the
  immune landscape of cancer. Immunity (under revision), preprint available in Biorxiv
• Bedognetti D. A multi-layer molecular fresco of the immune diversity across
  hematologic malignancies. Cancer Cell, September 2020.
• Ceccarelli…,Iavarone A, Verhaak R, et al. Molecular Profiling Reveals Biologically
  Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma, Cell, 2016
•  Rozenblit M…Marincola F, Bedognetti D, Adams S. Transcriptomic profiles conducive
  to immune-mediated tumor rejection in human breast cancer skin metastases treated
  with Imiquimod. Scientific Reports, 2019
• Bedognetti D, Hendrickx W, Ceccarelli M, Miller LD, Seliger B. Curr Opin Immunol. 2016
  Bedognetti D, …Rosenberg SA, Marincola FM. CXCR3/CCR5 pathways in metastatic
  melanoma patients treated with adoptive therapy and interleukin-2. British Journal of
  Cancer 2013.
• Insaldi E., Ballestrero A, Bedognetti D, Zoppoli G. Schlafen-11 expression is
  associated with immune signatures and basal-like phenotype in breast cancer. Breast
  Canc Res and Treat, 2019.
• Galon J, Angell HK, Bedognetti D, Marincola FM.The continuum of cancer immunosurveillance: prognostic, predictive, and mechanistic signatures. Immunity, 2013

In questi lavori scientifici, i proponenti hanno potuto dimostrare come mediante tecnologie di
Next Generation Sequencing sia possibile caratterizzare il tumore e il suo microambiente e
come sia possibile estrarre biomarcatori specifici di risposta alla immunoterapia. Questi articoli
scientifici sono stati accompagnati dallo sviluppo di protocolli software open source sviluppati
dagli stessi autori che saranno integrati con altre soluzioni sviluppate ad hoc ed ottimizzate nel
sistema ONCO-ND1. Alcuni di questi protocolli sono:

• ExomePipeline disponibile all’indirizzo https://github.com/miccec/ExomePipeline, per
  l’analisi, l’annotazione e la prioritizzazione clinica di dati da exome sequencing
• IPSC, disponibili all’indirizzo https://github.com/Sidra-TBI-FCO/ISPC per l’analisi
  integrata di mutazioni, espressione genica e copy number e loro associazione alla
  risposta immune intratumorale misurata mediante l’indice ICR (Immunological Constant
  of Rejection).

Il sistema ONCO-ND1 prevede che da un campione di biopsia in paraffina venga estratto una
quantità di DNA ed RNA sufficiente per un sequenziamento con Coverage medio > 200X su
tutto l’esoma (>20,000 geni), coverage ultra-deep sulle regioni del recettore delle Cellule T, e
in regioni che coprono geni di interesse per terapie targeted e un campione di sangue per
l’estrazione di DNA germinale al fine di identificare mutazioni specifiche nel tumore e per
l’identificazione di polimorfismi germinali I marcatori immunitari identificati dalla piattaforma
ONCO-ND1 sono:

• A Tumor Mutational Burden (associato a risposta all’ immunoterapia)
• B Neoantigen Load (associato a risposta all’ immunoterapia)
  – C La presenza dell’Instabilità dei microsatelliti (MSI) (forte predittore di risposta
  all’immunoterapia)
• D Repertorio dei recettori delle T-Cell (un’alta clonalità’ e’ associata a risposta
  all’immunoterapia) E
• E Il sottotipo HLA (la presenza di eterozigosità’ di HLA e’ associata ad alta risposta
  all’immunoterapia, alcuni aplotipi sono predittivi di rischio di sviluppo di polmoniti)
• F Espressioni delle signature immunitarie di immune risposta e resistenza (associate a
  risposta o resistenza all’immunoterapia)
• G La presenza di specifiche mutazioni tumorali somatiche associate a resistenza di
  immunoterapia (mutazioni specifiche della pathway dell’interferone e altre mutazioni
  quali quelle inerenti alle pathway EGFR/MAPK sono associate a resistenza
  all’immunoterapia)
• H La presenza di polimorfismi germinali associati a risposta
• I La composizione del microbioma tumorale (specifici batteri sono associati a risposta
  all’immunoterapia)
• L Espressione da sangue periferico di miRNA signatures predittive di riposta ad
  immunoterapia

La piattaforma ONCO-ORACLE è basata sui protocolli sviluppati nelle seguenti pubblicazioni
scientifiche:
– Nuzzo PV, Berchuck JE, Korthauer K, Spisak S,et al. Detection of renal cell carcinoma
using plasma and urine cell-free DNA methylomes. Nature Medicine 2020 Jul;26(7):
1041-1043.
– Lasseter K, Nassar AH, Hamieh L, Berchuck JE, Nuzzo PV, Korthauer K, Shinagare AB,
Ogorek B, McKay R, Thorner AR, Lee GM, Braun DA, Bhatt RS, Freedman M, Choueiri
TK, Kwiatkowski DJ. Plasma cell-free DNA variant analysis compared with methylated
DNA analysis in renal cell carcinoma. Genet Med. 2020 Aug;22(8):1366-1373.
La tecnica cfMeDIP–seq del lavoro Nuzzo et al. ha introdotto una metodica rivoluzionaria per
l’individuazione di alterazioni tumore-specifiche basate sul profilo di metilazione del cfDNA che
potenzialmente puo’ ridurre significativamente la mortalità attraverso l’identificazione precoce e
non invasiva della patologia tumorale e offrire un utile strumento per il monitoraggio dei pazienti
oncologici.
Con lo sviluppo del saggio cfMeDIP–seq ad alta sensitività è possibile introdurre nella pratica
clinica metodiche di screening precoce. Il saggio infatti si e’ dimostrato in grado di identificare
nel plasma la presenza del profilo di metilazione di sette tipi di tumore sia allo stadio iniziale che
metastatico (tumore del colon, pancreas, rene, mammella, polmone, uroteliale e leucemia
mieloide acuta) con altissima sensibilita’ e specificita’. Inoltre il saggio cfMeDIP-seq ha
dimostrato un’altissima sensibilità’ di diagnosi nel carcinoma renale, in cui sono completamente
assenti marcatori di screening e diagnosi precoce e nel 35% dei casi il tumore viene
diagnosticato in fase metastatica. Infatti nello studio di Nuzzo et al. Nature Medicine 2020
Jul;26(7): 1041-1043, in una ampia coorte di pazienti affetti da carcinoma renale, l’approccio
cfMeDIP–seq ha dimostrato un’accuratezza misurata mediante la curva ROC del 99% per
l’individuazione del carcinoma renale, anche nei pazienti allo stadio iniziale.
La piattaforma ONCO-ORACLE sara’ basata sulla industrializzazione del test cfMeDIP–seq, con
la possibilità’ di poterla utilizzare per tutte le tipologie tumorali grazie alla facilità’ di reperire i
campioni di plasma da analizzare, alla quantità’ minima di cfDNA per l’esecuzione del protocollo
di immunoprecipitazione ormai ottimizzato,alla velocità’ di sequenziamento e analisi dei
campioni sequenziati.
Il sistema ONCO-ND1 infatti prevede l’isolamento dal plasma del paziente di cfDNA e la sua
caratterizzazione del suo metiloma attraverso il saggio cfMeDIP-seq. E’ sufficiente un prelievo di
sangue nella classica provetta EDTA, che viene utilizzata per i comuni esami ematochimici,
per ottenere un 1ml di plasma dal quale verranno isolati 10 ng di cfDNA indispensabili per
l’analisi. Il cfDNA isolato viene sottoposto a un processo di immunoprecipitazione attraverso
l’utilizzo di un anticorpo diretto contro la 5-metil-citosina. Il cfmeDNA immunoprecipitato viene
amplificato e inviato sequenziamento high-throughput al fine di individuare le sequenze di
metilazione tumore-specifiche attraverso specifiche pipelines.